新興植物育種技術

基因改造生物依照歐盟定義為生物的遺傳物質由於人為操作而改變,而非經由自然交配或自然重組產生。可產生基因改造生物的技術包括重組核酸技術、顯微注射法、巨量注射法(基因槍)及不同科物種的細胞融合,但排除體外受精、自然發生之接合(conjugation)、傳導(transduction)或轉型(transformation),以及傳統突變與同科物種的細胞融合。瞭解新興植物育種技術的原理與方法,有助於釐清其屬性。

(一)定點核酸酶(site-directed nuclease, SDN)

定點核酸酶包括能辨識植物基因體特定序列之DNA結合區及作用於雙股DNA之核酸酶,可經客製化設計剪切特定之核酸序列。目前有三種主要的SDN 技術,包括MeganucleasesZinc-Finger Nucleases (ZFNs)Transcription Activator Like Effector Nucleases (TALENs)。當轉殖入植物細胞,SDN會在植物基因體之特定位置產生斷裂,而植物天然的DNA修復機制能夠辨識此斷裂,使用細胞中自然存在的酶將其修復。SDN技術能運用於植物育種,可使植物基因體之特定序列發生突變或嵌入基因片段。 

SDN技術可分為三類,即1. SDN-1:將表現SDN之基因轉殖入植物細胞內,所表現之SDN與植物基因體結合,在特定位置產生雙股斷裂,經由自然之非同源性DNA修補過程,使植物基因體的特定位置產生一個或數個鹼基對之任意點突變、小片段缺失或插入突變;2. SDN-2:將表現SDN之基因以及與目標區同源的小片段修補模版DNA轉殖入植物細胞內,所表現之SDN與植物基因體結合,在特定位置產生雙股斷裂,經由同源性重組及複製修補模版改變一個或數個鹼基對,產生特定位置之突變;3. SDN-3:將表現SDN及末端含有與斷裂點兩邊之DNA序列同源之大片段DNA(可達數千鹼基對)轉殖入植物細胞內,所表現之SDN與植物基因體結合,在特定位置產生雙股斷裂,經由同源性重組及複製,產生大片段DNA嵌入在特定位置。

(二)寡核苷酸定點突變(oligonucleotide-directed mutagenesis, ODM)

ODM是利用寡核苷酸誘導植物基因體中一個或幾個相聯的目標核苷酸突變。可藉由ODM導入新的突變(取代一個或數個鹼基對)、反轉原本存在的突變點或誘導小片段的缺失突變。ODM通常使用與宿主基因體目標序列不同但具高度同源性的20 ~ 100個核苷酸,亦可使用由DNARNA及單股DNA所構成的混合寡核苷酸。

寡核苷酸可用不同的方法轉殖入不同的細胞形態,在植物組織中常用基因槍法(bombardment),而在植物原生質體(protoplasts)中常用電穿孔法(electroporation)。寡核苷酸會與植物基因體中同源序列形成配對,在非互補的核苷酸產生一個或多個錯配的鹼基對,細胞修補系統可以辨認錯配,進而誘導修正產生突變。寡核苷酸在細胞內會被降解,但所誘導之突變會穩定的遺傳。

(三)同源基因轉殖(cisgenesis/intragenesis)

同源基因轉殖所植入之DNA片段必須是來自於物種本身或可交配之物種。所嵌入之基因、內含子(intron)及相關的調控因子完全未受改變者為cisgenesis,而所嵌入之基因是物種本身或可交配物種的DNA片段組合者為intragenesis。此兩種方法僅cisgenesis可達到以傳統育種也能獲得之結果,但可縮短大量時間。Intragnesis允許基因與不同的啟動子及調控因子組合,更有選擇性地修飾基因的表現;intragnesis也包括利用RAN干擾(RNAi)使特定基因無法表現。 

同源基因轉殖植物與基因改造植物是利用相同的轉型技術產生,目前研究最多的cisgenic植物是馬鈴薯及蘋果,最常用的轉型技術是農桿菌媒介(Agrobacterium-mediated),但有時也會以基因槍進行。

(四)依賴RNADNA甲基化(RNA-dependent DNA methylation, RdDM)

RdDM能使育種者所育成之植株不含外來DNA序列,在核苷酸序列上沒有任何的改變或突變,但基因表現有所變異。RdDM是將目標基因之啟動子序列甲基化而抑制基因之轉錄,其方法是將可轉錄出與目標基因啟動子同源RNA的基因片段藉由轉形送入植物細胞內,轉錄後產生雙股RNA,經過細胞內特殊酵素的作用,誘導目標啟動子序列的甲基化,進而抑制目標基因的表現。進行RdDM的過程中某些階段會產生基因改造植物。

甲基化狀態在植物減數分裂中是安定的,啟動子甲基化會遺傳至子代。經RdDM所產生的植物之子代,有部分會因遺傳定律而不含轉殖基因,但仍保有甲基化狀態,且尚可延續數代,爾後會逐漸減少至消失。

(五)嫁接(grafting)

嫁接是將一種植物的幼芽接到另一種植物的砧木(rootstock),以改善作物的特性。藉由基因改造技術改善植物砧木的生根能力或抵抗土壤病害,可增加果實的產量。如果基因改造植物的幼芽被嫁接到非基因改造植物的砧木,則莖、葉、花、果實及種子都將成為基因改造。當非基因改造植物的幼芽被嫁接到基因改造植物的砧木,則莖、葉、花、果實及種子之基因並不會被改變,但若基因改造植物的砧木是以RNAi 使基因無法表現,嫁接植物中之小RNA分子可以經由嫁接移動至幼芽,影響幼芽基因的表現。

(六)反向育種(reverse breeding)

雜交產生異型合子(heterozygous)優良品系為植物育種最重要的目標之一,但雜交優勢之本質難以掌握。反向育種是藉由抑制減數分裂過程中之重組,產生原雜交植物的互補同型合子(homozygous)品系,一旦雜交就可以重建原本之異型合子優良品系,不需要進行回交及篩選,可大幅縮減育種所需時間。 

反向育種的方法包括下列步驟:1.挑選欲被重建的異型合子優良品系;2.藉由轉殖RAN干擾基因,抑制dmc1spo11基因的表現,而使異型合子優良品系在減數分裂時無法重組;3.由含轉殖基因的異型合子優良品系之未成熟花粉產生單倍體孢子;4.利用單倍體加倍技術(doubled haploid, DH)將單倍體孢子的染色體加倍,產生雙倍體之同型合子細胞;5.培養同型合子細胞以得到同型合子植株;6.篩選出不含轉殖基因而雜交後可產生原本之異型合子優良品系的互補同型合子植株。篩選出的互補同型合子植株經雜交後,即可重建原本之異型合子優良品系。

(七)農桿菌滲入法(agro-infiltration, agro-inoculation, floral dip)

    將基因改造農桿菌之懸浮液利用針筒注射或真空滲透入植物組織(通常為非生殖組織,如葉片),進行轉殖基因之瞬間大量表現。此技術常用在研究上,如植物與病原菌在植物組織中交互作用或測試調節因子的功效,但由於此技術系統也能得到高產量的重組蛋白質,所以也被發展成高價位重組蛋白質之生產平台。

農桿菌滲入法可以用來篩選具有用性狀的植株,然後再運用在育種中,例如取病原菌的基因進行農桿菌滲入可用以評估植物的抗性,具抗性的植株就可以直接被用為育種的親本。由於以農桿菌滲入所得植株的生殖細胞基因體並未嵌入任何基因片段,所得到的子代為非基因改造植物。此外,也可用與篩選所得植株具相同基因的其它植株作為親本。 

農桿菌滲入法可依照組織及基因構築區分成三類,即1. Agro-infiltration sensu stricto:非生殖細胞(一般為葉)以不可複製的基因構築進行農桿菌滲入,目的在於使浸泡區域得到局部表現;2. Agro-inoculation agro-infection:非生殖細胞(一般為葉)以全長病毒載體上有外來基因的構築進行農桿菌滲入,目的在於使全植株皆有基因的表現;3. Floral dip:將生殖細胞(一般為花)浸泡於含DNA構築的農桿菌液中,目的在於獲得到轉型的胚,在發芽階段中能被篩選出,能得到穩定性轉型植株,因此所得到的植株為基因改造作物。

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