細菌與黴菌之污染測試

1. 操作原理:

  1. 使用直接培養法,將測試樣品接種於適當之微生物培養基中,於培養箱培養後,觀察微生物培養基是否產生變化或出現菌落, 用以檢測細菌與黴菌之污染。
  2. 測試之微生物包括細菌〈好氧與厭氧菌〉、酵母菌與黴菌。
  3. 使用之微生物培養基與測試菌類如表一所示。其中trypticase soy broth、brain heart infusion broth、blood agar及 thioglycollate medium 可以廣泛偵測細菌污染,Sabouraud dextrose broth、YM broth 及 nutrient broth with yeast extract 可以偵測黴菌污染,可依實際需要而選擇數種培養基測試之。表一、微生物培養基種類
    培養基測試菌類
    Trypticase soy broth細菌
    Brain heart infusion broth細菌
    Blood agar plate細菌與厭氧菌
    Thioglycollate medium厭氧菌
    Sabouraud dextrose broth酵母菌與黴菌
    YM broth酵母菌與黴菌
    Nutrient broth with 2% yeast extract細菌,酵母菌與黴菌
    YM broth酵母菌與黴菌
  4.  除了接種至微生物培養基外,亦可以在顯微鏡下直接觀察測試樣品是否有微生物污染,或是取樣測試樣品作染色觀察。

2. 材料:

  1. 微生物培養基
  2. Trypticase soy broth
  3. Brain heart infusion (BHI) broth
  4. Blood agar plates
  5. Thioglycollate medium
  6. Sabouraud dextrose broth
  7. YM broth
  8. Nutrient broth with 2% yeast extract
  9. 厭氧缸及厭氧試劑
  10. 附蓋玻璃試管〈16 x 100 mm〉
  11. 無菌培養皿

3. 培養基配製:

  1. Trypticase soy broth (Difco 0370-17-3):稱取 30 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
  2. Brain heart infusion (BHI) broth (Difco 0037-17):稱取37 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
  3. Thioglycollate medium (Difco 0256-17-2):稱取29.8 g 粉末溶於1000 ml水中,加熱至沸騰使其完全溶解,分裝10 ml至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
  4. Sabouraud dextrose broth (Difco 0382-17-9):稱取30 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
  5. YM broth (Difco 0711-01):稱取21 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
  6. Nutrient broth (Difco 003-01) with 2% yeast extract (Difco 0127-01):稱取8 g nutrient broth與20g Bacto yeast extract粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
  7. Blood agar plates
    1. 稱取40 g blood agar base(Difco 0045-01) 溶於950 ml水中,加熱使其溶解,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
    2. 待溫度降低至50℃,加入5% (50ml) 無菌去凝血纖維之兔血或羊血,混合均勻,分裝至培養皿,貯存於4℃。
    3. 亦可使用已配製好之培養基:Blood agar plate(BBL-4321261,trypticase soy agar with 5% sheep blood)

4. 測試樣品:

  1. 樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞,須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞,可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞,取樣前先吸除大部分培養基,並刮下少許吸附之細胞與剩餘之3-5 ml 培養基混合後,才進行取樣。
  2. 測試樣品應不含抗生素,以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉,則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌3次, 以移除任何殘留之抗生素。

5. 步驟:

  1. 分別接種測試樣品至液體微生物培養基與blood agar plate。
  2. 液體微生物培養基:取樣約 0.1~1 ml 測試樣品,分別接種至 2 管液體微生物培養基中,然後分別置於37℃ 培養箱與室溫〈20℃~30℃〉下培養14~21天。
  3. Blood agar plate:取樣約 0.2 ml 測試樣品,分別接種至 2 個 agar plate上,其中一個 blood agar plate 置於厭氧缸中,加入厭氧試劑後置於37℃ 培養箱培養14天。另一個 blood agar plate 則直接置於37℃ 培養箱培養14天。
    培養基溫度Gas phase培養天數(天)
    Trypticase soy broth37℃
    26℃
    aerobic14
    Brain heart infusion broth37℃
    26℃
    aerobic14
    Blood agar plate37℃
    26℃
    aerobic
    anaerobic
    14
    Thioglycollate broth37℃
    26℃
    aerobic14
    Sabouraud broth37℃
    26℃
    aerobic21
    YM broth37℃
    26℃
    aerobic21
    Nutrient broth with 2% yeast extract37℃
    26℃
    aerobic21

6. 結果判讀:

  1. 陽性反應:
    1. 液體培養基:呈現混濁或絲狀懸浮物,可在顯微鏡下觀察細菌、酵母菌或黴菌之出現。
    2. blood agar plate:出現菌落。
  2. 陰性反應:液體培養基沒有混濁或絲狀懸浮物,且 blood agar plate 沒有菌落產生。

7. 參考資料:

Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality control methods for cell lines, second edition. American Type Culture Collection, Manassas, Virgina.