細胞繼代培養

  1. 前言:
    1. 細胞生長至高密度時,即須收集細胞,分殖至新的培養瓶中,其稀釋比例依細胞種類而異。
    2. 收集細胞方法可用trypsin-EDTA、cell scraper、離心處理等,處理方法依細胞種類而異。
    3. Trypsin-EDTA為收集吸附型細胞常用之方法。Trypsin為胰蛋白酵素,其作用為分解細胞與瓶壁之附著蛋白, EDTA為chelating agent,其作用為去除Ca2+、Mg2+等離子,trypsin與EDTA二者共同作用,可使附著之細胞自瓶壁脫落。 除了trypsin-EDTA,亦可使用cell scraper(細胞刮勺)刮落細胞。
    4. Trypsin-EDTA作用時間勿太久,否則可能對細胞造成傷害或死亡。敲拍培養瓶不可太過猛烈, 避免對細胞造成傷害或造成培養瓶裂痕而污染。
  2. 材料:
    1. Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free
    2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na):若為大體積包裝,建議將其以 少量分裝於無菌試管中,保存於-20℃,避免反覆冷凍解凍造成trypsin之活性降低,並可減少污染之機會。使用前放在37℃水槽中回溫。
    3. 新鮮培養基
    4. 無菌吸管/離心管/培養瓶。
  3. 步驟:
    1. 附著型細胞(adherent cell)
      1. 吸掉舊培養液。
      2. 用Dulbecco’s phosphate-buffered saline洗滌細胞一至二次。
      3. 加入trypsin-EDTA溶液(1ml/T-25 flask, 2ml/T-75 flask):
        1. 方法一:37℃或室溫作用數分鐘,於倒立顯微鏡下觀察,當細胞將要分離而呈現圓粒狀時, 吸掉trypsin-EDTA溶液,輕敲培養瓶邊緣使細胞自瓶壁脫落,然後加入適量之新鮮培養基,與脫落之細胞或細胞團塊混和均勻後,依稀釋比例轉移至新的培養瓶中,依正常條件繼續培養之。
        2. 方法二:37℃或室溫作用數分鐘,待細胞自瓶壁脫落後,加入適量含血清之新鮮培養基,以終止trypsin作用﹙因血清中含有trypsin inhibitor,可以終止trypsin作用﹚,離心後去除上清液,或不作離心處理 ,添加新鮮培養基後依稀釋比例轉移至新的培養瓶中,依正常條件繼續培養之。
    2. 懸浮型細胞(suspension cell)
      1. 吸出細胞培養液,放入離心管中,離心1000 rpm、 5分鐘。
      2. 吸除上清液,加入適量之新鮮培養基,與沉澱細胞(cell pellet)混和均勻後,依稀釋比例轉移至新的培養瓶中,依正常條件繼續培養。
    3. 融合瘤﹙hybridoma﹚
      1. 有些hybridoma cell需培養三天以上才會產生抗體,若是更換培養基,則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心後更換培養基,直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。