細胞計數與存活測試

1. 前言:
1.1. 計算細胞數目可用血球計數盤或是自動粒子計數器(Coulter counter),可依實驗需要使用之。
1.2. 血球計數盤有二個chamber,每個chamber中細刻 9 個 1 mm2之大正方形, 其中位於4個角落之正方形再細刻16個小格,深度均為0.1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻片後,每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm = 1.0 x10-4 ml 。使用時,計數每個大正方形內之細胞數目,乘以稀釋倍數,再乘以104,即為每 ml 中之細胞數目。
1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion,利用染料 (例如trypan blue) 會滲入死細胞中而呈色,而活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會呈色。
2. 材料:
2.1. 0.4% w/v Trypan blue
2.2. 血球計數盤 (Hemocytometer) 及蓋玻片
2.3. 計數器(counter)
3.

步驟:

3.1. 取100 ul 細胞懸浮液與100 ul trypan blue 等體積混合均勻。
3.2. 取少許混合液﹙約15 ul) 自血球計數盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,於100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色, 死細胞則為藍色。
3.3. 計數四個大方格之細胞總數,再除4,乘以稀釋倍數﹙至少乘以2 ,因與trypan blue等體積混合﹚,最後乘以104,即為每 ml中細胞懸浮液之細胞數。
4大格細胞總數 x 2 x 104 / 4 = 細胞數/ml
3.4. 若不用血球計數盤,可用自動粒子計數器 (Coulter counter, Coulter Electronics) 作自動計數, 但無法辨別死細胞或活細胞。
3.5. 若細胞數目太多,可先用phosphate buffer saline (PBS) 稀釋後再計數之。若細胞沉澱物太多而干擾染色與計數, 可將其離心處理後 (1000 rpm, 5分鐘),再計數之。
Comments