細胞冷凍保存

  

1.

前言:

1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長旺盛﹙例如 log phase﹚且存活率高之狀態,約為80% - 90%緻密度。
1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質,例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
1.3. 一般冷凍保護劑為5~10% DMSO。應注意冷凍保護劑之品質,DMSO應為tissue culture等級,無色且無菌﹙以 0.22 micron FGLP Telflon filter過濾或是直接購買無菌產品﹚。若為大體積包裝,將其以少量分裝,4℃避光保存,勿作多次冷凍解凍循環。
1.4. 冷凍保存之細胞濃度:1~5 x 106 cells/ml
1.5. 若是不確定細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個backup culture,若冷凍失敗,仍有預留之細胞存在。
2. 材料:
2.1. 新鮮培養基
2.2. DMSO
2.3. 無菌塑膠冷凍保存管
2.4. -20℃ 冰箱
2.5. -80℃ 冰箱
2.6. 程式降溫機 (可有或無)
3. 步驟:
3.1. 冷凍前應注意細胞生長情形,可在一日前更換半量或全量培養基。
3.2. 配製冷凍保存溶液(使用前配製):將DMSO加入新鮮培養基中,使其最終濃度為5~10%,混合均勻,置於室溫下待用。
3.3. 依細胞繼代培養之操作,收集細胞,並取少量細胞懸浮液計數細胞濃度及凍前存活率。
3.4. 將收集之細胞離心1000 rpm、5分鐘後,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,混合均勻後,使細胞濃度為1~5 x 106 cells/ml,分裝至冷凍保存管中, 每管分裝 1 ml。
3.5. 冷凍保存方法 1:冷凍管置於 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** → 移至-80℃、16~18小時(或隔夜)→移至液氮槽vapor phase長期儲存。
** 註:-20℃不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞死亡。亦可跳過此步驟,冷凍管置於厚保麗龍盒內,直接放入-80℃冰箱,但存活率會降低。
3.6. 冷凍保存方法 2:冷凍管置於已設定程式之程式降溫機中,以每分鐘降1~3℃速率降至-80℃以下,然後放入液氮槽之vapor phase長期儲存。
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