細菌與黴菌之污染測試

 1. 操作原理:
1.1 使用直接培養法,將測試樣品接種於適當之微生物培養基中,於培養箱培養後,觀察微生物培養基是否產生變化或出現菌落, 用以檢測細菌與黴菌之污染。 
1.2 測試之微生物包括細菌〈好氧與厭氧菌〉、酵母菌與黴菌。 
1.3 使用之微生物培養基與測試菌類如表一所示。其中trypticase soy broth、brain heart infusion broth、blood agar及 thioglycollate medium 可以廣泛偵測細菌污染,Sabouraud dextrose broth、YM broth 及 nutrient broth with yeast extract 可以偵測黴菌污染,可依實際需要而選擇數種培養基測試之。 
  
表一、微生物培養基種類

培養基


測試菌類
Trypticase soy broth 細菌
Brain heart infusion broth 細菌
Blood agar plate 細菌與厭氧菌
Thioglycollate medium 厭氧菌
Sabouraud dextrose broth 酵母菌與黴菌
YM broth 酵母菌與黴菌
Nutrient broth with 2% yeast extract 細菌,酵母菌與黴菌
YM broth 酵母菌與黴菌

1.4 除了接種至微生物培養基外,亦可以在顯微鏡下直接觀察測試樣品是否有微生物污染,或是取樣測試樣品作染色觀察。
 
 2. 材料: 
 2.1 微生物培養基 
 2.1.1 Trypticase soy broth
 2.1.2 Brain heart infusion (BHI) broth
 2.1.3 Blood agar plates
 2.1.4 Thioglycollate medium
 2.1.5 Sabouraud dextrose broth
 2.1.6 YM broth
 2.1.7 Nutrient broth with 2% yeast extract
 2.2 厭氧缸及厭氧試劑 
 2.3 附蓋玻璃試管〈16 x 100 mm〉 
 2.4 無菌培養皿 

 3. 培養基配製:   
3.1
Trypticase soy broth (Difco 0370-17-3):稱取 30 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
3.2
Brain heart infusion (BHI) broth (Difco 0037-17):稱取37 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
3.3
Thioglycollate medium (Difco 0256-17-2):稱取29.8 g 粉末溶於1000 ml水中,加熱至沸騰使其完全溶解,分裝10 ml至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
3.4
Sabouraud dextrose broth (Difco 0382-17-9):稱取30 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
3.5
YM broth (Difco 0711-01):稱取21 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
3.6
Nutrient broth (Difco 003-01) with 2% yeast extract (Difco 0127-01):稱取8 g nutrient broth與20g Bacto yeast extract粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
3.7
Blood agar plates
3.7.1
稱取40 g blood agar base(Difco 0045-01) 溶於950 ml水中,加熱使其溶解,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
3.7.2
待溫度降低至50℃,加入5% (50ml) 無菌去凝血纖維之兔血或羊血,混合均勻,分裝至培養皿,貯存於4℃。
3.7.3
亦可使用已配製好之培養基:Blood agar plate
(BBL-4321261,trypticase soy agar with 5% sheep blood)

4. 測試樣品: 
 4.1 樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞,須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞,可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞,取樣前先吸除大部分培養基,並刮下少許吸附之細胞與剩餘之3-5 ml 培養基混合後,才進行取樣。 
 4.2 測試樣品應不含抗生素,以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉,則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌3次, 以移除任何殘留之抗生素。 

 5. 步驟: 
 5.1 分別接種測試樣品至液體微生物培養基與blood agar plate。 
 5.2 液體微生物培養基:取樣約 0.1~1 ml 測試樣品,分別接種至 2 管液體微生物培養基中,然後分別置於37℃ 培養箱與室溫〈20℃~30℃〉下培養14~21天。 
 5.3 Blood agar plate:取樣約 0.2 ml 測試樣品,分別接種至 2 個 agar plate上,其中一個 blood agar plate 置於厭氧缸中,加入厭氧試劑後置於37℃ 培養箱培養14天。另一個 blood agar plate 則直接置於37℃ 培養箱培養14天。   
  
培養基 溫度 Gas phase

培養天數(天)

Trypticase soy broth 37℃
26℃
aerobic 14
Brain heart infusion broth 37℃
26℃
aerobic 14
Blood agar plate 37℃
37℃
aerobic
anaerobic
14
Thioglycollate broth 37℃
26℃
aerobic 14
Sabouraud broth 37℃
26℃
aerobic 21
YM broth 37℃
26℃
aerobic 21
Nutrient broth with 2% yeast extract 37℃
26℃
aerobic 21

6. 結果判讀: 
 6.1 陽性反應: 
 6.1.1 液體培養基:呈現混濁或絲狀懸浮物,可在顯微鏡下觀察細菌、酵母菌或黴菌之出現。 
 6.1.2 blood agar plate:出現菌落。 
 6.2 陰性反應:液體培養基沒有混濁或絲狀懸浮物,且 blood agar plate 沒有菌落產生。 

 7. 參考資料:Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality control methods for cell lines, second edition. American Type Culture Collection, Manassas, Virgina.  
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