黴漿菌之污染測試--直接培養法

1. 操作原理:
培養黴漿菌於黴漿菌培養基中,觀察菌落之生成。此方法是目前最直接與靈敏之步驟,亦是用來評估其他偵測新步驟之標準步驟之一。 缺點為培養時間長,須3~5星期才能判斷。且有些黴漿菌不易在目前之培養基中培養出來 (例如 M. hyorhinis)。
2. 材枓:
2.1 黴漿菌培養基
2.1.1 dextrose
2.1.2 L-arginine HCl
2.1.3 Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1)
2.1.4 horse serum (heat-inactivated, 56℃, 30 min)
2.1.5 15% yeast extract solution (autoclaved)
2.1.6 Bacto agar
2.2 陽性反應對照菌株
2.2.1 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206)
2.2.2 Mycoplasma arginini (ATCC 23838)
2.3 附蓋玻璃試管〈16 x 100 mm〉〈已滅菌〉
2.4 6 cm 無菌培養皿
2.5 厭氧缸與厭氧試劑
3. 配製培養基:
3.1 培養基有broth〈液體〉及agar plate〈固體〉二種型式,其基本配方皆為Difco PPLO broth*(60%)、heat-inactivated馬血清(20%)、 15% yeast extract solution (10%)、與 10x stock solution (10%)。由於培養時間長,可加入penicillin(最終濃度為500 units/ml)至10x stock solution(見3.2)或加入thallium acetate (最終濃度為 1:2000)至培養基中(見3.3 與 3.4),以防止其他細菌污染。
*註:亦可使用 Mycoplasma broth base (Becton-Dickison 11458) 或
Mycoplasma agar base (Becton-Dickison 11456)
3.2 10x stock solution (1 liter)
3.2.1 稱取 50 g dextrose 和 10 g L-arginine HCl,37℃溶於 1 liter蒸餾水中。
3.2.2 以 0.22 μm 無菌過濾膜過濾滅菌。
3.2.3 分裝 100 ml至瓶中,保存於 -70℃。
3.3 Mycoplasma broth (1 liter)
3.3.1 稱取 21 g 之 Difco PPLO broth,0.02 g phenol red 於 600 ml 蒸餾水中,加熱攪拌溶解之,滅菌121℃、15 lb、15分鐘。
3.3.2 待溫度降低至室溫後,於無菌操作台內加入 200 ml 之 heat-inactivated 馬血清,100 ml 之 autoclaved 15% yeast extract solution,及100 ml 解涷之 10x stock solution,混合均勻後,分裝至已滅菌之有蓋玻璃試管中,10 ml/管。
3.4 Mycoplasma agar (1 liter)
3.4.1 稱取 21 g 之 Difco PPLO broth,0.02 g phenol red,15 g Bacto agar* 於 600 ml 蒸餾水中,加熱溶解之。 3.4.2. 滅菌121℃,15分鐘。
* 註:或用 Difco PPLO agar 取代
3.4.2 滅菌121℃,15分鐘。
3.4.3 放在 50℃ 水中浴中,待溫度降低至 50℃ 時,於無菌操作台內加入200 ml 之 heat-inactivated 馬血清,100 ml 之 15% autoclaved yeast extract solution 及 100 ml 解凍之 10x stock solution,混合均勻後,倒入無菌培養皿中。
4. 測試樣品:
4.1 樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞,須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞,可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞,取樣前先吸除大部分培養基, 並刮下少許吸附之細胞與剩餘之 3~5 ml 培養基混合後,才進行取樣。
4.2 測試樣品應不含抗生素以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉,則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌 3 次, 以移除任何殘留之抗生素。
5. 步驟:
5.1 分別接種測試樣品至 Mycoplasma broth 與 Mycoplasma agar plate 中。
5.2 Mycoplasma broth:取樣約 0.1 ml~1 ml 測試樣品接種於 Mycoplasma broth 中,置於 37℃ 培養二週,持續觀察是否有混濁或是 pH 值改變之情形。 在培養一週及二週後,分別取樣約 0.2 ml 之 Mycoplasma broth 接種於 Mycoplasma agar plate,將此 agar plate 放入厭氧缸中,加入厭氧試劑後置於 37℃ 培養箱培養〈或是使用5% CO2-95% nitrogen 之厭氧箱〉,培養至少3星期,持續觀察是否有黴漿菌之菌落出現。
5.3 Mycoplasma agar plate:取樣約 0.2 ml 測試樣品接種於 Mycoplasma agar plate 上,將此 agar plate 放入厭氧缸中,加入厭氧試劑後置於 37℃ 培養箱培養〈或是使用5% CO2-95% nitrogen 之厭氧箱〉,培養至少3星期,持續觀察 agar plate 上是否有黴漿菌菌落出現。
5.4 須作正負反應對照組,正反應對照組為 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與 M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。
6. 結果判讀:
6.1 陽性反應:Mycoplasma agar plate 上有類似荷包蛋(fried- egg like)之細小菌落產生,可在100倍放大倍率之顯微鏡下觀察。
6.2 陰性反應:Mycoplasma agar plate 上沒有菌落產生。
7. 注意事項:
7.1 黴漿菌生長較慢,所以除了接種 Mycoplasma agar plate 外,亦同時接種於 Mycoplasma broth ,以達增值之作用,於 Mycoplasma broth 增殖一及二週後,再轉移至 agar plate 培 養。需至少培養3星期後,才可斷定是否有黴漿菌污染結果,所以整個測試需五個星期才知正確結果。
7.2 典型之黴漿菌菌落類似荷包蛋(fried- egg like),為圓形無色之細小透明菌落,可藉100倍放大倍率之顯微鏡觀察之。
7.3 若要區分細胞樣品造成的類似菌落,可將其自 agar plate 上切下,重新培養於液體培養基中,培養一星期後再種入 agar plate,觀察菌落之形成,或將其自 agar plate 上切下,重新以其他黴漿菌測試〈例如 DNA 螢光染色或 PCR方法〉。
7.4 若有非荷包蛋型之菌落出現,需與其他黴漿菌測試方法比對〈例如 DNA 螢光染色或 PCR方法〉,再判定測試結果。
8. 參考資料:Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality control methods for cell lines, second edition. American Type Culture Collection, Manassas, Virgina.
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