無菌操作基本技術


1. 實驗進行前,無菌室及無菌操作台(laminar flow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌,以70% ethanol擦拭無菌操作抬面,並開啟無菌操作台風扇運轉10分鐘後,才開始實驗操作。
2. 每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共用培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。
3. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其他實驗用品用完即應移出,以利於氣流之流通。實驗用品以70% ethanol擦拭後才帶入無菌操作台內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。
4. 小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。
5. 實驗完畢後,將實驗物品帶出工作台,以70% ethanol擦拭無菌操作檯面。操作間隔應讓無菌操作台運轉5-10分鐘後,再進行下一個細胞株之操作。
6. 工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套後才進行實驗。對於來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,並選擇適當等級之無菌操作台(至少Class II)。操作過程中,應避免引起aerosol之產生,小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等,並避免尖銳針頭之傷害等。
7. CO2培養箱 :
7.1. 細胞培養是否需二氧化碳供應,依細胞培養基種類而異。
7.2. 若細胞培養基以碳酸鹽為pH緩衝系統,則需補充二氧化碳以達到緩衝作用,應培養細胞於二氧化碳環境下,例如使用二氧化碳培養箱﹙常用之比例為5% CO2,95% air﹚,或是 灌入適量二氧化碳至培養容器內,放入一般培養箱中培養即可。為使二氧化碳能夠流通,培養瓶(例如T-flask)放入二氧化碳培養箱時應鬆開瓶蓋,或使用透氣瓶蓋。取出觀察時,則關緊瓶蓋,以避免污染。
7.3. 若細胞培養基含有其他緩衝物質而不需二氧化碳供應,則放在一般培養箱中培養即可。
7.4. 培養箱內可放置水盤以維持適量之溼度,避免因培養基蒸發造成鹽類濃度之變化而影響細胞生長。
8. 定期檢測下列項目:
8.1. 無菌操作台:注意airflow壓力,定期更換紫外線燈管、HEPA過濾膜及prefilter預濾網﹙300小時/預濾網,3000小時/HEPA﹚。
8.2. CO2培養箱:CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染。
8.3. CO2鋼瓶:CO2壓力
8.4. 恆溫水槽:定期換水
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