血清與生長測試

  1. 血清必須貯存於-20℃~-70℃,勿長期存放於4℃。對於大體積之包裝(例如500 ml/瓶),如果一次無法用完一瓶,可將其以40 ml分裝於無菌50 ml離心管中,由於血清結凍時體積會增加約10%,必須預留此膨脹體積之空間,否則易發生污染或容器凍裂之情形。 
  2. 一般廠商提供之血清為無菌,不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物,則可將血清加入培養基內一起過濾,勿直接過濾血清。
  3. 大體積瓶裝(500 ml/瓶)血清解凍步驟 (逐步解凍法):自-20℃或-70℃冰箱取出冷凍瓶裝(500 ml)之血清,置於4℃冰箱溶解1~2天,然後放在室溫下或37℃恆溫水槽 使其完全溶解後,待全部溶解後再分裝。在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一,以減少沈澱的發生,勿直接由-70℃放入37℃解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質沈澱物。 若血清依正常解凍程序解凍後,仍出現過多沉澱物,則應停止使用,更換另一批號的血清。
  4. 小體積(例如40 ml)分裝之血清可存放於-20℃或-80℃冰箱,使用時直接置於37℃恆溫水槽解凍即可,若有少數沉澱物,可將其離心3000 rpm, 5分鐘後,去除沉澱物。
  5. Heat-inactivation是指56℃, 30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement)去活化。除非必須,一般不建議作此熱處理,因為會造成沈澱物之顯著增多,且會影響血清之品質。
  6. 勿將血清置於37℃太久,若在37℃放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定之成份亦會因此受到破壞,而影響血清之品質。
  7. 血清之生長測試
    7.1. 前言:血清為細胞培養基之重要添加物,不同廠牌與批號之血清品質差異很大,若要大量購入某類血清,應作適當之選擇與篩選,測試血清對細胞生長之影響,然後才引進之。

    7.2.

材料:
    7.2.1. MDCK cell (ATCC CCL-34或CCRC 60004)或其他細胞株
    7.2.2. MEM (minimal essential medium)
    7.2.3. 6-well cell culture plate (or 35mm cell culture dish)
    7.2.4. methanol
    7.2.5. glacial acetic acid
    7.2.6. 10% Giemsa solution

    7.3.

步驟:
    7.3.1. 以MEM with 10% fetal bovine serum(已測試過)培養MDCK細胞於T75 flask至80% confluency。
    7.3.2. 以trypsin-EDTA處理細胞,離心後,加入適量不加血清之MEM製成細胞懸浮液,並測細胞濃度。以不加血清之MEM稀釋細胞濃度為1×102個活細胞數 / ml。
    7.3.3. 將1 ml細胞懸浮液接種入6-well cell culture plate中,並另加入1 ml含不同濃度的血清(20 % , 10% , 4% , 2% , 1% , 0.4%)之MEM,使血清最終濃度為10% , 5% , 2% , 1% , 0.5% , 0.2%。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。
    7.3.4. 於37℃,5 % CO2培養箱培養5~7天,期間不需更換培養基,待細胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸即可。
    7.3.5. 去除培養基,加入1 ml Carnoy's固定液(甲醇體積:冰醋酸體積﹦3:1),室溫下靜置10 min。
    7.3.6. 去除固定液,水洗二次。
    7.3.7. 加入1 ml 10% Giemsa solution,室溫下靜置染色2-3 min。
    7.3.8. 去除染液,水洗二次。
    7.3.9. 以肉眼計數群落數
    7.3.10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency ):

               SPE = ( No. of colonies / well ) / 100 x 100%

    7.3.11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency):
               RPE =[total colonies of six well (test) / total colonies of six well (control) ] x 100%

    7.4.

比較各濃度血清培養基之RPE,即可得知待測血清對細胞生長的影響。

    7.5.

訂購多量同一批號的優良血清,置於-70℃保存之。
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