紅麴二次代謝物及其生合成相關基因之研究

monacolin K


紅麴菌代謝物中也是目前功能研究最清楚就是monacolin K,因與一種降血脂的處方藥lovastatin (mevinolin,商品名Mevacor)為同結構之化合物,而被廣泛應用調節血脂之保健素材。處方藥lovastatin已經確認的藥理作用為HMG-CoA reductase抑制劑,在膽固醇合成路徑中與HMG-CoA競爭還原酶而抑制該還原酶反應,成為高血脂或高膽固醇的第一線用藥。其實真正作用的化合物是mevinolinic acid,因為mevinolin是一個前趨藥物(prodrug),也就是非活性狀態,口服進入體內後才被水解成為hydoxy-acid form,才能作用在藥物標的上。從1987年美國藥物食品檢驗局(FDA)通過上市許可成為第一個statin的藥物,而開啟statin類藥物的研發,從早期由微生物發酵在藥物製程上是以Aspergillus terreus發酵生產lovastatin,發展到再以此為原料藥進行化學修飾合成simvastatin,成為第二代statin產品,其次是ML-236B (compactin)為另一真菌Penicillium citrinum之生成代謝物,同樣也是具以此為原料藥進行化學修飾合成pravastatin,在臨床上同樣也是廣泛做為治療高血脂所使用。
紅麴菌代謝物中其他monacolin類的研究並不多,但是非常多樣,圖二為從紅麴發酵米中所分離到的monacolin類約14個化合物之結構,同樣有acid form的存在及代謝中間物等monacolin的衍生物,這些結構類似物可以透過HPLC結合UV偵測建立monacolin結構代謝物的指紋圖譜(圖三),可做為產品的品管分析甚至可以定量(Li et al., 2004)。
由於statin藥品市場的蓬勃,也使得研究學者想盡快解出在真菌中生產lovastatin生成相關基因群,以便能應用分子生物技術做菌種的改良。圖四為A. terreus負責生成lovastatin一共有17個基因(James et al., 2008),共64kb參與此生成反應。這一類PK是兩個HR PK包括nonaketide及diketide組合起來,主要架構是nonaketide也就是LovB基因參與之化合物生成,一共包含七個蛋白質區域,KS, AT, DH, MT, ER, KR 及ACP(James et al., 2008)。
LovB亦被稱為lovastatin nonaketide合成酶(LNKS),表現該基因在A. nidulans提供了一個證據說明在此酵素的ER區域蛋白質並沒有活性,而主要的酵素活性是表現在LovC蛋白質中的ER區域蛋白質(Hoffmeister and Keller, 2007),如圖五所示。
由於compactin結構與lovastatin類似,而在分子研究上發現參與代謝生合成路徑之蛋白質功能區域上具有高度保留性,也因此Chen等人利用引子設計從紅麴菌M. pilosus選殖出與monacolin K生成相關的基因組(Chen et al., 2008),發現確實與已發表的lovastatin與compactin生合成基因組的基因排列相同,在胺基酸序列具有高度保留性。為確認選殖之相關基因與monacolin K生合成相關,於是利用mokA基因,就是與lovB lovastatin nonaketide合成酶(LNKS)基因具高度保留性,進行基因破壞影響基因功能後,發現無法生合成monacolin K。同樣的,Kanae Sakai等人(Sakai et al., 2009)也在同種不同分離株選殖了這些相關基因,並利用monk B基因的破壞使得菌株無法生成monacolin K來證明該基因確實參與monacolin K的生合成功能,不僅如此還發現累積了一個中間產物的產量大增,由結構確認証實為monacolin J。

這些基因的了解使得化學家認為第二代statin類藥物的半合成中,化學反應所參與的步驟亦可以透過酵素來參與。主要是因為在合成路徑中monacolin J是中間物,經過LovD一個acyl transferase (AT)將N-acetylcysteamine(SNAC)thioester轉移到monacolin J而成為simvastatin藥物,過去這個步驟需要7-8的化學反應,如此一來只要一個生物轉換步驟,就可以達成這樣的結果。主要是因為在A. terreus中LovF參與diketide合成後,經過LovD的催化,將此diketide化合物轉移到monacolin J第一個碳上的氫氧基上,而形成lovastatin,如圖七所示(Xie et al., 2006)。


LovD具有基質選擇性,所以研究人員將LovD基因單獨在大腸桿菌進行表現後,發現可表現出具有立體選擇性之LovD蛋白質,同時測部分基質發現催化將基質轉移到monacolin J的活化基上而成為lovastatin的結構類似物(analog),但是因為酵素具有立體選擇性,所以轉換效率也因為基質的不同而有所不同,表二是研究人員經過HPLC分析後所發現的。

citrinin

另一個被研究較多的就是citrinin(橘毒素),為紅麴菌代謝生成的一種真菌毒素。Citrinin最早發現是在P. citrinum,而後在其他真菌如Aspergillus及Monascus屬種中發現。在紅麴中發現主要是因為歐盟核准使用紅麴色素作為食品添加物,由Blanc等學者(Blanc et al., 1995)從分離鑑定紅麴色素時發現另一種化合物,被命名為monascidin A。此真菌毒素citrinin具有肝毒性及腎毒性,產品中若還有此毒素將會影響成為食品添加物或保健食品用途上之限制。目前日本在第七版食品添加物公定書中,紅麴色素使用增列了citrinin需小於0.2 ppm,而國內也於2006年5月17日公告修正之健康食品管理辦法中,第三條申請查驗登記之健康食品條文之第二項成分符合中央主管機關所定之健康食品規格標準,應發給健康食品許可證。故於2007年12月31日開始實施之紅麴健康食品規格標準中,第三條第二項紅麴產品規格成分中限定citrinin含量不得超過百萬分之二,即是需小於2 ppm。但在2009年8月18日由行政院衛生署食品衛生處預告訂定「食品中真菌毒素限量標準」草案中,第五條更為明確定義食品中橘黴素citrinin限量應符合表五所列。


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