細胞計數與存活測試

  1. 前言：
    1. 計算細胞數目可用血球計數盤或是自動粒子計數器(Coulter counter)，可依實驗需要使用之。
    2. 血球計數盤有二個chamber，每個chamber中細刻 9 個 1 mm2之大正方形， 其中位於4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻片後，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm = 1.0 x10-4 ml 。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每 ml 中之細胞數目。
    3. 存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料 (例如trypan blue) 會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。
  2. 材料：
    1. 0.4% w/v Trypan blue
    2. 血球計數盤 (Hemocytometer) 及蓋玻片
    3. 計數器(counter)
  3. 步驟：
    1. 取100 ul 細胞懸浮液與100 ul trypan blue 等體積混合均勻。
    2. 取少許混合液﹙約15 ul) 自血球計數盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，於100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色， 死細胞則為藍色。
    3. 計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數﹙至少乘以2 ，因與trypan blue等體積混合﹚，最後乘以104，即為每 ml中細胞懸浮液之細胞數。
      4大格細胞總數 x 2 x 104 / 4 = 細胞數/ml
    4. 若不用血球計數盤，可用自動粒子計數器 (Coulter counter, Coulter Electronics) 作自動計數， 但無法辨別死細胞或活細胞。
    5. 若細胞數目太多，可先用phosphate buffer saline (PBS) 稀釋後再計數之。若細胞沉澱物太多而干擾染色與計數， 可將其離心處理後 (1000 rpm, 5分鐘)，再計數之。