細菌與黴菌之污染測試
1. 操作原理:
- 使用直接培養法,將測試樣品接種於適當之微生物培養基中,於培養箱培養後,觀察微生物培養基是否產生變化或出現菌落, 用以檢測細菌與黴菌之污染。
- 測試之微生物包括細菌〈好氧與厭氧菌〉、酵母菌與黴菌。
- 使用之微生物培養基與測試菌類如表一所示。其中trypticase soy broth、brain heart infusion broth、blood agar及 thioglycollate medium 可以廣泛偵測細菌污染,Sabouraud dextrose broth、YM broth 及 nutrient broth with yeast extract 可以偵測黴菌污染,可依實際需要而選擇數種培養基測試之。表一、微生物培養基種類
培養基 | 測試菌類 |
Trypticase soy broth | 細菌 |
Brain heart infusion broth | 細菌 |
Blood agar plate | 細菌與厭氧菌 |
Thioglycollate medium | 厭氧菌 |
Sabouraud dextrose broth | 酵母菌與黴菌 |
YM broth | 酵母菌與黴菌 |
Nutrient broth with 2% yeast extract | 細菌,酵母菌與黴菌 |
YM broth | 酵母菌與黴菌 |
- 除了接種至微生物培養基外,亦可以在顯微鏡下直接觀察測試樣品是否有微生物污染,或是取樣測試樣品作染色觀察。
2. 材料:
- 微生物培養基
- Trypticase soy broth
- Brain heart infusion (BHI) broth
- Blood agar plates
- Thioglycollate medium
- Sabouraud dextrose broth
- YM broth
- Nutrient broth with 2% yeast extract
- 厭氧缸及厭氧試劑
- 附蓋玻璃試管〈16 x 100 mm〉
- 無菌培養皿
3. 培養基配製:
- Trypticase soy broth (Difco 0370-17-3):稱取 30 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
- Brain heart infusion (BHI) broth (Difco 0037-17):稱取37 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
- Thioglycollate medium (Difco 0256-17-2):稱取29.8 g 粉末溶於1000 ml水中,加熱至沸騰使其完全溶解,分裝10 ml至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
- Sabouraud dextrose broth (Difco 0382-17-9):稱取30 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
- YM broth (Difco 0711-01):稱取21 g 粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
- Nutrient broth (Difco 003-01) with 2% yeast extract (Difco 0127-01):稱取8 g nutrient broth與20g Bacto yeast extract粉末溶於1000 ml水中,分裝10 ml 至有蓋玻璃試管中,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
- Blood agar plates
- 稱取40 g blood agar base(Difco 0045-01) 溶於950 ml水中,加熱使其溶解,高壓蒸汽滅菌121℃、15lb、15分鐘。
- 待溫度降低至50℃,加入5% (50ml) 無菌去凝血纖維之兔血或羊血,混合均勻,分裝至培養皿,貯存於4℃。
- 亦可使用已配製好之培養基:Blood agar plate(BBL-4321261,trypticase soy agar with 5% sheep blood)
4. 測試樣品:
- 樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞,須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞,可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞,取樣前先吸除大部分培養基,並刮下少許吸附之細胞與剩餘之3-5 ml 培養基混合後,才進行取樣。
- 測試樣品應不含抗生素,以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉,則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌3次, 以移除任何殘留之抗生素。
5. 步驟:
- 分別接種測試樣品至液體微生物培養基與blood agar plate。
- 液體微生物培養基:取樣約 0.1~1 ml 測試樣品,分別接種至 2 管液體微生物培養基中,然後分別置於37℃ 培養箱與室溫〈20℃~30℃〉下培養14~21天。
- Blood agar plate:取樣約 0.2 ml 測試樣品,分別接種至 2 個 agar plate上,其中一個 blood agar plate 置於厭氧缸中,加入厭氧試劑後置於37℃ 培養箱培養14天。另一個 blood agar plate 則直接置於37℃ 培養箱培養14天。
培養基 | 溫度 | Gas phase | 培養天數(天) |
Trypticase soy broth | 37℃
26℃ | aerobic | 14 |
Brain heart infusion broth | 37℃
26℃ | aerobic | 14 |
Blood agar plate | 37℃
26℃ | aerobic
anaerobic | 14 |
Thioglycollate broth | 37℃
26℃ | aerobic | 14 |
Sabouraud broth | 37℃
26℃ | aerobic | 21 |
YM broth | 37℃
26℃ | aerobic | 21 |
Nutrient broth with 2% yeast extract | 37℃
26℃ | aerobic | 21 |
6. 結果判讀:
- 陽性反應:
- 液體培養基:呈現混濁或絲狀懸浮物,可在顯微鏡下觀察細菌、酵母菌或黴菌之出現。
- blood agar plate:出現菌落。
- 陰性反應:液體培養基沒有混濁或絲狀懸浮物,且 blood agar plate 沒有菌落產生。
7. 參考資料:
Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality control methods for cell lines, second edition. American Type Culture Collection, Manassas, Virgina.