黴漿菌之污染測試–直接培養法

1. 操作原理：

培養黴漿菌於黴漿菌培養基中，觀察菌落之生成。此方法是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其他偵測新步驟之標準步驟之一。 缺點為培養時間長，須3~5星期才能判斷。且有些黴漿菌不易在目前之培養基中培養出來 (例如 M. hyorhinis)。

2. 材枓：

  1. 黴漿菌培養基
    1. dextrose
    2. L-arginine HCl
    3. Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1)
    4. horse serum (heat-inactivated, 56℃, 30 min)
    5. 15% yeast extract solution (autoclaved)
    6. Bacto agar
  2. 陽性反應對照菌株
    1. Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206)
    2. Mycoplasma arginini (ATCC 23838)
  3. 附蓋玻璃試管〈16 x 100 mm〉〈已滅菌〉
  4. 6 cm 無菌培養皿
  5. 厭氧缸與厭氧試劑

3. 配製培養基：

  1. 培養基有broth〈液體〉及agar plate〈固體〉二種型式，其基本配方皆為Difco PPLO broth*(60%)、heat-inactivated馬血清(20%)、 15% yeast extract solution (10%)、與 10x stock solution (10%)。由於培養時間長，可加入penicillin(最終濃度為500 units/ml)至10x stock solution（見3.2）或加入thallium acetate (最終濃度為 1：2000)至培養基中（見3.3 與 3.4），以防止其他細菌污染。
    *註：亦可使用 Mycoplasma broth base (Becton-Dickison 11458) 或
    Mycoplasma agar base (Becton-Dickison 11456)
  2. 10x stock solution (1 liter)
    1. 稱取 50 g dextrose 和 10 g L-arginine HCl，37℃溶於 1 liter蒸餾水中。
    2. 以 0.22 μm 無菌過濾膜過濾滅菌。
    3. 分裝 100 ml至瓶中，保存於 -70℃。
  3. Mycoplasma broth (1 liter)
    1. 稱取 21 g 之 Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 於 600 ml 蒸餾水中，加熱攪拌溶解之，滅菌121℃、15 lb、15分鐘。
    2. 待溫度降低至室溫後，於無菌操作台內加入 200 ml 之 heat-inactivated 馬血清，100 ml 之 autoclaved 15% yeast extract solution，及100 ml 解涷之 10x stock solution，混合均勻後，分裝至已滅菌之有蓋玻璃試管中，10 ml/管。
  4. Mycoplasma agar (1 liter)
    1. 稱取 21 g 之 Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15 g Bacto agar* 於 600 ml 蒸餾水中，加熱溶解之。 3.4.2. 滅菌121℃，15分鐘。
      * 註：或用 Difco PPLO agar 取代
    2. 滅菌121℃，15分鐘。
    3. 放在 50℃ 水中浴中，待溫度降低至 50℃ 時，於無菌操作台內加入200 ml 之 heat-inactivated 馬血清，100 ml 之 15% autoclaved yeast extract solution 及 100 ml 解凍之 10x stock solution，混合均勻後，倒入無菌培養皿中。

4. 測試樣品：

  1. 樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞，須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞，可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞，取樣前先吸除大部分培養基， 並刮下少許吸附之細胞與剩餘之 3~5 ml 培養基混合後，才進行取樣。
  2. 測試樣品應不含抗生素以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉，則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌 3 次， 以移除任何殘留之抗生素。

5. 步驟：

  1. 分別接種測試樣品至 Mycoplasma broth 與 Mycoplasma agar plate 中。
  2. Mycoplasma broth：取樣約 0.1 ml~1 ml 測試樣品接種於 Mycoplasma broth 中，置於 37℃ 培養二週，持續觀察是否有混濁或是 pH 值改變之情形。 在培養一週及二週後，分別取樣約 0.2 ml 之 Mycoplasma broth 接種於 Mycoplasma agar plate，將此 agar plate 放入厭氧缸中，加入厭氧試劑後置於 37℃ 培養箱培養〈或是使用5% CO2-95% nitrogen 之厭氧箱〉，培養至少3星期，持續觀察是否有黴漿菌之菌落出現。
  3. Mycoplasma agar plate：取樣約 0.2 ml 測試樣品接種於 Mycoplasma agar plate 上，將此 agar plate 放入厭氧缸中，加入厭氧試劑後置於 37℃ 培養箱培養〈或是使用5% CO2-95% nitrogen 之厭氧箱〉，培養至少3星期，持續觀察 agar plate 上是否有黴漿菌菌落出現。
  4. 須作正負反應對照組，正反應對照組為 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與 M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。

6. 結果判讀：

  1. 陽性反應：Mycoplasma agar plate 上有類似荷包蛋(fried- egg like)之細小菌落產生，可在100倍放大倍率之顯微鏡下觀察。
  2. 陰性反應：Mycoplasma agar plate 上沒有菌落產生。

7. 注意事項：

  1. 黴漿菌生長較慢，所以除了接種 Mycoplasma agar plate 外，亦同時接種於 Mycoplasma broth ，以達增值之作用，於 Mycoplasma broth 增殖一及二週後，再轉移至 agar plate 培 養。需至少培養3星期後，才可斷定是否有黴漿菌污染結果，所以整個測試需五個星期才知正確結果。
  2. 典型之黴漿菌菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，為圓形無色之細小透明菌落，可藉100倍放大倍率之顯微鏡觀察之。
  3. 若要區分細胞樣品造成的類似菌落，可將其自 agar plate 上切下，重新培養於液體培養基中，培養一星期後再種入 agar plate，觀察菌落之形成，或將其自 agar plate 上切下，重新以其他黴漿菌測試〈例如 DNA 螢光染色或 PCR方法〉。
  4. 若有非荷包蛋型之菌落出現，需與其他黴漿菌測試方法比對〈例如 DNA 螢光染色或 PCR方法〉，再判定測試結果。

8. 參考資料：

Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality control methods for cell lines, second edition. American Type Culture Collection, Manassas, Virgina.