血清與生長測試

血清必須貯存於-20℃～-70℃，勿長期存放於4℃。對於大體積之包裝(例如500 ml/瓶)，如果一次無法用完一瓶，可將其以40 ml分裝於無菌50 ml離心管中，由於血清結凍時體積會增加約10％，必須預留此膨脹體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。

一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。

大體積瓶裝（500 ml/瓶）血清解凍步驟 (逐步解凍法)：自-20℃或-70℃冰箱取出冷凍瓶裝（500 ml）之血清，置於4℃冰箱溶解1~2天，然後放在室溫下或37℃恆溫水槽使其完全溶解後，待全部溶解後再分裝。在溶解過程中須規則搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，以減少沈澱的發生，勿直接由-70℃放入37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質沈澱物。若血清依正常解凍程序解凍後，仍出現過多沉澱物，則應停止使用，更換另一批號的血清。

小體積（例如40 ml）分裝之血清可存放於-20℃或-80℃冰箱，使用時直接置於37℃恆溫水槽解凍即可，若有少數沉澱物，可將其離心3000 rpm, 5分鐘後，去除沉澱物。

Heat-inactivation是指56℃, 30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份（complement）去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沈澱物之顯著增多，且會影響血清之品質。

勿將血清置於37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質。

血清之生長測試

前言：血清為細胞培養基之重要添加物，不同廠牌與批號之血清品質差異很大，若要大量購入某類血清，應作適當之選擇與篩選，測試血清對細胞生長之影響，然後才引進之。

材料：

MDCK cell (ATCC CCL-34或CCRC 60004)或其他細胞株

MEM (minimal essential medium)

6-well cell culture plate (or 35mm cell culture dish)

methanol

glacial acetic acid

10% Giemsa solution

步驟：

以MEM with 10% fetal bovine serum（已測試過）培養MDCK細胞於T75 flask至80% confluency。

以trypsin-EDTA處理細胞，離心後，加入適量不加血清之MEM製成細胞懸浮液，並測細胞濃度。以不加血清之MEM稀釋細胞濃度為1×102個活細胞數 / ml。

將1 ml細胞懸浮液接種入6-well cell culture plate中，並另加入1 ml含不同濃度的血清（20 % , 10% , 4% , 2% , 1% , 0.4%）之MEM，使血清最終濃度為10% , 5% , 2% , 1% , 0.5% , 0.2%。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。

於37℃，5 % CO2培養箱培養5~7天，期間不需更換培養基，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

去除培養基，加入1 ml Carnoy’s固定液（甲醇體積：冰醋酸體積﹦3：1），室溫下靜置10 min。

去除固定液，水洗二次。

加入1 ml 10% Giemsa solution，室溫下靜置染色2-3 min。

去除染液，水洗二次。

以肉眼計數群落數

計算SPE ( Serum Plating Efficiency )：SPE = ( No. of colonies / well ) / 100 x 100%

計算RPE(Relative Plating Efficiency)：RPE =[total colonies of six well (test) / total colonies of six well (control) ] x 100%

比較各濃度血清培養基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。

訂購多量同一批號的優良血清，置於-70℃保存之。