黴漿菌之污染測試–DNA螢光染色法

1. 操作原理：

  1. 利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測黴漿菌污染。此染劑會結合到 DNA 之 Adenosine-Thymidine (A-T) rich 區域，因為黴漿菌之 DNA 中 A-T 含量佔多數（55～80%），所以可將其染色而偵測。被黴漿菌污染之細胞經染色後，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點。
  2. 測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養液接種於指示細胞培養液中（indicator cell，例如 Vero cell or 3T6 cell），培養指示細胞後再作螢光染色。正負反應對照組亦可以接種於 indicator cell 內作為對照。
  3. 待測細胞亦可培養後直接作螢光染色，但需為吸附型細胞。若有些細胞易有螢光背景，而干擾結果判讀，則建議使用1.2之步驟。

2. 材料︰

  1. 試劑
    1. bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)
    2. thimerosol (Sigma T-5125)
    3. Hanks’ balanced salt solution without sodium bicarbonate or phenol red
    4. 0.1M citric acid
    5. 0.2M disodium phosphate
    6. glycerol
    7. glacial acetic acid
    8. methanol
  2. 陽性反應對照菌株
    1. Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206)
    2. Mycoplasma arginini (ATCC 23838)
  3. chamber slide (Nunc 177380) 或 chamber slide 替代物：在 35 or 60mm sterile plate 內放置無菌22 x 22 mm蓋玻片﹙可將蓋玻片浸於酒精內，使用前以過火來滅菌之﹚，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色後取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。
  4. 指示細胞〈indicator cell〉: Vero (CCRC 60013) 2.5 Vero 細胞培養基：MEM with 10% fetal bovine serum 2.6 螢光顯微鏡：激發濾鏡〈excitation filter〉波長為340-380 nm，阻斷濾鏡〈barrier filter〉波長為430 nm。

3. 試劑配製:

  1. 無菌HBSS︰Hanks’ balanced salt solution 以0.22 um 無菌過濾膜過濾後才使用之。
  2. Hoechst 33258 stock solution（50 ug/ml, 100X stock solution）︰
    稱取5.0 mg bisbenzimide 和 10.0 mg thimersol 溶於 100 ml 無菌HBSS，置於棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30-45分鐘至完全溶解後，以 1 ml 小體積分裝，貯存於-20℃。此染劑對光與熱敏感，所以應置於棕色瓶中並以鋁箔紙包覆，並於低溫保存。
  3. Hoechst 33258 working reagent（0.5 ug/ml）︰
    取1 ml Hoechst 33258 stock solution〈見3.2〉，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌30-45分鐘，置於棕色瓶中並以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存於4℃。
  4. mounting solution︰混合 22.2 ml 0.1 M citric acid、27.8 ml 0.2 M disodium phosphate 和 50 ml glycerol，調整 pH 至 5.5，貯存於4℃。
  5. 固定溶液（fixative）︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配製。

4. 測試樣品：

  1. 樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞，須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞，可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞，取樣前先吸除大部分培養基， 並刮下少許吸附之細胞與剩餘之 3~5 ml 培養基混合後，才進行取樣。
  2. 測試樣品應不含抗生素以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉，則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌 3 次， 以移除任何殘留之抗生素。

5. 步驟：

  1. 培養Vero細胞：
    1. 於測試前一週培養 Vero 細胞。或 Vero 細胞可作長期培養或製作多個冷凍保存管，測試前再解凍培養。
    2. 在接種測試樣品前一日，以 trypsin-EDTA 溶液處理 Vero 細胞，製成細胞懸浮液，以 1~2 x 104 cells／ml 培養於 chamber slide中，每個 well 加入 1 ml 細胞懸浮液，於37℃, 5％CO2培養。隔日確定生長良好後，即可接種測試樣品。
  2. 接種測試樣品：
    1. 將 0.2~0.5 ml 之測試樣品加入chamber slide 內，培養5天，進行 Hoechst 33258 的螢光染色觀察。
    2. 測試之細胞亦可直接接種於 chamber slide 或 coverslip 上，亦培養5天以上不更換培養基，然後進行螢光染色。
    3. 以 Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染 Vero 細胞作為正反應對照組﹙或是已感染黴漿菌之細胞培養液或冷凍細胞懸浮液﹚，負反應對照組為 Vero cell 之新鮮培養基(MEM + 10% FBS)。

6. DNA螢光染色檢測*︰

  1. 取出培養 5-6 日之 Vero 細胞，吸除舊培養液。
  2. 於每個 well 中加入 2 ml 之 1:3 體積混合的冰醋酸/甲醇固定液，室溫下靜置 10 min 後，吸除固定液。重複此步驟 2 次。在加入與吸除固定液期間，勿讓 culture dry。
  3. 風乾10分鐘。
  4. 於每個 well 中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置 30 min。
  5. 吸掉 Hoechst 33258 染液後，以無菌水洗滌3次，風乾後加入1滴的 mounting solution，並以蓋玻片覆蓋之。
  6. 以 100 倍至 400 倍螢光顯微鏡觀察，激發濾鏡〈excitation filter〉波長為340-380 nm，阻斷濾鏡〈barrier filter〉波長為430 nm。觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產生。
    * 註： 測試之細胞亦可直接接種於 chamber slide 或 coverslip 上，其固定與染色方法同上。

7. 結果判讀︰

  1. 陽性反應：
    除了細胞核會呈現藍色螢光外，在與細胞表面與細胞核外會出現藍色螢光小點或是絲狀點，其螢光點很小且形狀一致，與細胞核殘片染成之不規則之較大點狀物不同，且其螢光維持較久，可維持數星期。若仍無法判讀，可在 1000 倍顯微鏡下觀察以區分之。
  2. 陰性反應：
    只出現細胞核之藍色螢光點，在細胞核外與細胞表面沒有藍色螢光小點或絲狀點

(A) 陰性反應

(B) 陽性反應

8. 注意事項︰

  1. 測試樣品之細胞懸浮液在接種至 Vero 細胞後，可能會發生凋亡〈apoptosis〉現象，而產生許多細胞核碎片干擾結果判讀。 若發生此狀況，必須有經驗之人員判讀。
  2. 若細胞固定步驟或染色後之洗滌步驟處理不好，則可能出現螢光背景，細胞質亦被染色，而干擾結果判讀，可用無菌水洗滌數次，或靜置數日待螢光背景減弱後，再觀察之。

9. 參考資料：

Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality control methods for cell lines, second edition. American Type Culture Collection, Manassas, Virgina.