細胞冷凍保存

  1. 前言：
    1. 欲冷凍保存之細胞應在生長旺盛﹙例如 log phase﹚且存活率高之狀態，約為80％ – 90％緻密度。
    2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
    3. 一般冷凍保護劑為5~10% DMSO。應注意冷凍保護劑之品質，DMSO應為tissue culture等級，無色且無菌﹙以 0.22 micron FGLP Telflon filter過濾或是直接購買無菌產品﹚。若為大體積包裝，將其以少量分裝，4℃避光保存，勿作多次冷凍解凍循環。
    4. 冷凍保存之細胞濃度：1~5 x 106 cells/ml
    5. 若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，若冷凍失敗，仍有預留之細胞存在。
  2. 2. 材料：
    1. 新鮮培養基
    2. DMSO
    3. 無菌塑膠冷凍保存管
    4. -20℃ 冰箱
    5. -80℃ 冰箱
    6. 程式降溫機 (可有或無)
  3. 步驟：
    1. 冷凍前應注意細胞生長情形，可在一日前更換半量或全量培養基。
    2. 配製冷凍保存溶液（使用前配製）：將DMSO加入新鮮培養基中，使其最終濃度為5~10％，混合均勻，置於室溫下待用。
    3. 依細胞繼代培養之操作，收集細胞，並取少量細胞懸浮液計數細胞濃度及凍前存活率。
    4. 將收集之細胞離心1000 rpm、5分鐘後，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，混合均勻後，使細胞濃度為1~5 x 106 cells/ml，分裝至冷凍保存管中， 每管分裝 1 ml。
    5. 冷凍保存方法 1：冷凍管置於 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** → 移至-80℃、16～18小時（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase長期儲存。** 註：-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞死亡。亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍盒內，直接放入-80℃冰箱，但存活率會降低。
    6. 冷凍保存方法 2：冷凍管置於已設定程式之程式降溫機中，以每分鐘降1~3℃速率降至-80℃以下，然後放入液氮槽之vapor phase長期儲存。