黴漿菌之污染測試--PCR法

原理：

利用具特殊專一性之primers，經由PCR反應來複製mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由於此段spacer之序列依mycoplsma種類不同而不同，因此可依所複製之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑑定。

  1. 特點：
    1. 靈敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)。
    2. 可偵測不易培養之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。
    3. 不需培養mycoplasma作為正反應對照組，避免可能之污染。
  2. 缺點︰
    1. PCR反應很靈敏，易有偽陽性結果。
    2. 此方法尚在評估中，故結果僅作為參考和內部品管之一部份。

材料與設備：

  1. ATCC mycoplasma detection kit:
    1. 可作50～100 reactions.
    2. 提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture
    3. positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
  2. PCR reagents :
    1. Taq polymerase ( 5 U / ul )
    2. dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
    3. 10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
    4. 25mM MgCl2
    5. sterile ddH2O
  3. Machine / Equipment :
    1. PCR thermal cycler
    2. agarose電泳設備
    3. DNA電泳膠體觀察設備
    4. 手套
    5. 無菌PCR反應管
    6. 無菌1.5 ml微量離心管
    7. 無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

方法：

此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1 st stage PCR結束後，取其反應物作2nd stage PCR，然後取2 nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。

  1. 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
    1. 測試樣品 ( 2 ul / each )
      1. 直接取樣測試細胞之培養液。
      2. Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
      3. Negative control : ddH2O
    2. Reaction mixture ( 23 ul / each )
      1. 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
      2. 1st stage primer mixture 0.5 ul
      3. dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
      4. MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
      5. Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
      6. ddH2O 18.4 ul
    3. PCR program ( 1st PCR與2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler
      1. step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
      2. step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
      3. step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
      4. step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
      5. 重複3.1.3.2至3.1.3.4步驟30 cycles
      6. step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
  2. nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
    1. 測試樣品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
    2. Reaction mixture ( 24 ul / each )
      1. 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
      2. 2 nd stage primer mixture 0.5 ul
      3. dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
      4. MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
      5. Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
      6. ddH2O 19.4 ul
  3. PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler

膠片電泳分析

  1. 膠片 (2.0%) 置備: 將2 g agarose溶於100 ml ( 1x ) TAE buffer。
  2. 電泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）
  3. 選擇100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
  4. 取10 ul 2 nd stage PCR產物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
  5. 進行電泳分離100V, 25 min。
  6. 膠片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr為致癌物質，請戴手套並小心操作）
  7. 結果：使用UV light觀察，並照相記錄。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)

Table 1 : Variations of restriction fragment lengths of the 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of commonly encountered species of mycoplasma. (from ATCC mycoplasma detection kit)

Mycoplasma speciesSize of 2nd stage PCR productSize of restriction Fragments (bp)
  
Vsp IHind IIICla I
M. arginini236 bp134, 102--
M. fermentans365 bp270, 95241, 124-
M. hominis**236 bp123, 113-253, 62
M. hyorhinis315 bp---
M. oral290 bp151, 139--
M. pirum323 bp169, 154285, 38-
M. salivarium269 bp---
A. laidlawii426 bp219, 198--
219 bp189, 39--

* No restriction site
** When a polyacrylamide gel is used for the resolution of amplified DNA products, a double-band product with one bp difference may be observed for M. hominis. This feature can serve as a good indicator for differentiated M. hominis from M. arginini, which only produces a single-band DNA product.